Azokban az esetekben, ahol a szervezet védekezőrendszere valamilyen okból legyengített, megnő a szisztémás gombás fertőzések előfordulási valószínűsége.

Septicaemias candidiasis gyakran a szájüreg kolonizációja után vagy olyan betegekben jelentkezik, akik megelőzően oropharyngealis candidiasisban szenvedtek.

E tények ismeretében azt vizsgáltuk, hogy önmagában a nyál képes-e gátló hatást gyakorolni a Candida albicans növekedésére, valamint ezen élesztő akrilátlapokhoz való kitapadására. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a nyál, in vitro körülmények között, bizonyos mértékű gátlást (8-10%-os) fejt ki a Candida albicans növekedésére, és a protézis alapanyagát képező akrilátlapokhoz történő kitapadására is hasonló hatással van (7-8%-os). A növekedési vizsgálatokban alkalmazott nagyobb mennyiségű nyál esetén az ismételten elvégzett kísérletek során sem tapasztaltunk gátlást. A gátlás elmaradása, illetve bizonyos mértékű növekedésserkentés valószínűleg azzal magyarázható, hogy a nyál összetevői a kísérleti körülmények között a tenyészet számára tápanyagként szolgálhatnak. Vizsgálati eredményeink, melyek szerint a nyál mind a növekedést, mind az inert felszínhez való tapadást bizonyos mértékig fékezi, valamint az a tapasztalat, hogy ennek ellenére ez a gomba igen sok ember szájüregében megtalálható, azt támasztják alá, hogy a nyál önmagában nem képes a Candida albicans eliminálására. Ha a Candida már megtelepedett a szájüreg szövetein vagy a benne elhelyezett protézis felszínén, a kellemetlenségeken túl már egészségügyi problémákat is okoz, a későbbi komplikációk elkerülése érdekében szükséges beavatkozni. Amennyiben az élő szövetekhez adszorbeálódik az élesztő, úgy antifungális szer alkalmazása szükséges. Irodalmi adatok alapján a flukonazol hatását a laktoferrin szinergista módon támogatja [4.]. Abban az esetben, ha a gomba adhéziója a protézisen jelentős, akkor antifungális szer alkalmazása nem indokolt, ezzel szemben más, a gomba növekedését csökkentő vegyület használata lehetőséget ad az eliminációra.


Bevezetés

A Candida albicans által okozott megbetegedések

Mindenki által jól ismert élesztő a Candida albicans. Gyakorta megtalálható - mint az ember normál mikroflórájának tagja - a szájüregben, a gastrointestinalis tractusban, valamint a női nemi szervek nyálkahártyáján. Jelentősége abban áll, hogy egyes terápiás beavatkozások során, mint a szteroidterápia, a citosztatikus kezelés vagy a transzplantáció, illetve a gazdaszervezet bizonyos elváltozásaiban, mint például diabetes mellitus, az AIDS, a leggyakoribb opportunista gombás fertőzés kórokozója lehet. Tehát amíg a szervezet normális működése esetén nem okoz megbetegedést, a gazdaszervezet-gomba közti egyensúly felborulásakor a szervezet immunrendszerétől függően változó súlyosságú fertőzések okozója lehet.

A Candida albicans, kezdve a jelentéktelennek tűnő bőrgombásodástól egészen a súlyos, gyakran letális szisztémás fertőzésekig, sokféle megbetegedést okozhat. A bőrt, a nyálkahártyát és a belső szerveket érintő Candida mycosis (candidosis) a leggyakrabban előforduló sarjadzó gombás betegség [5.]. Az ennél sokkal súlyosabb, szisztémás gombás fertőzések előfordulási valószínűsége azokban az esetekben nő meg, ahol a szervezet védekezőrendszere valamilyen okból legyengített. A kialakuló septicaemias candidiasis nagyon gyakran jelentkezik tünetmentes szájüregi kolonizációt követően, illetve olyan betegeken, akik megelőzően oropharyngealis candidiasisban szenvedtek.

A szájüregi gombás fertőzéseket az alábbi csoportokba sorolhatjuk be:

‚ pseudomembranosus candidiasis,
‚ erythematosus/atrophias candidiasis,
‚ hyperplasticus/candida leukoplakia,
‚ stomatitis protetica,
‚ cheilitis angularis,
‚ glossitis mediana rhomboica,
‚ chronicus multifocalis oralis candidiasis,
‚ szisztémás fertőzésekhez társuló candidiasis [6.].

Bizonyos prediszponáló tényezők, mint a xerostomia, a nem kielégítő szájhigiénia, a kivehető műfogsor viselése, az inhalációs és szisztémás szteroidkezelés, a hosszan tartó antibiotikus terápia, a vérképző szervi malignusmegbetegedések, valamint a veleszületett és szerzett immunhiányos állapotok hajlamosítanak az orális candidiasis kialakulására [7., 8.].

Régóta ismert tény, hogy a műfogsorral rendelkező egyének szájüregében a Candida albicans által kialakított infekciók előfordulása gyakoribb. Az élesztősejtek adhéziója a gazdaszervezet sejtjei mellett állandóan jelen lévő fogpótlások felszínén fontos szerepet játszik a gomba patogenezisében. A szájüregi candidiasis gyakran letális szisztémás candidiasis forrása lehet, ezért az előbb említett rizikócsoportokba tartozó betegeknél a Candida fajok által okozott fertőzés kezelése alapvető jelentőségű. A Candida albicans által okozott fertőzések ellen az egészséges szervezet védekezik. A szájüreg különleges helyzetű ebből a szempontból, mivel itt az immunrendszer hatása kiegészül a nyál védőhatásával. Ezért a hatásért a benne található nem specifikus védekezőproteinek tehetők felelőssé. Melyek ezek? A lizozim, az "A" típusú immunglobulin, a hisztatin, valamint a laktoferrin. Irodalmi adatok bizonyítják, hogy ezen összetevők közül legnagyobb jelentőséggel a laktoferrin rendelkezik. Ez egy olyan vaskötő glikoprotein, amely relatíve nagy koncentrációban van jelen a különböző exokrin szekrétumokban, így a nyálban is, és széles spektrumú antimikrobás hatással rendelkezik (antibakteriális, antifungális, antivirális). Vas nélküli formája, az apolaktoferrin, mind a Candida cruseit, mind a Candida albicanst képes elpusztítani. Hatásának alapja, hogy a gomba sejtfelszínével való közvetlen kontaktusa által megváltoztatja annak permeabilitását, s ezáltal letális hatással van a különböző Candida speciesekre [4.].

Ha a szervezet védekezőképessége elégtelen a fertőzés leküzdéséhez, különböző antifungális szerek állnak rendelkezésünkre. A humán patogén gombák által okozott fertőzések kezelésében nehézséget jelenthet az is, hogy a gombák ellen - mint eukarióta szervezetek ellen - nehezebb szelektív hatású anyagot találni.

Az antifungális szereket biokémiai támadáspontjuk alapján az alábbi csoportokra oszthatjuk:

‚ sejtmembrán-szteroid szintézist gátlók: azolok,
‚ sejtmembrán-funkciót gátlók: polién makrolidok,
‚ nukleinsav-szintézist gátlók: fluorocytosin,
‚ mitózist gátlók: griseofulvin [5.].

A laktoferrin és az antifungális szerek szinergista hatása miatt lehetővé vált, hogy egy standard antimikrobás terápia során, azt laktoferrin hozzáadásával kiegészítve, az antimikotikum szintje csökkenthető. Így csökken a terápiarezisztens törzsek kialakulásának valószínűsége, ezért ez a kombináció számos Candida infekció esetén vonzó terápiás lehetőséget nyújthat [4.].


A Candida albicans morfológiája

A Candida albicans 3 jellegzetes mikroszkopikus megjelenést mutat: sarjsejt, fonalas forma, pszeudohifák végén képződő klamidospórák [3.] (1. ábra).


1. ábra: A Candida albicans 3 jellegzetes mikroszkopikus megjelenési formája: a: pszeudohifák, b: sarjadzó gombasejtek, c: klamidospórák


A leggyakoribbak a sarjadzó gombasejtek (1. kép), amelyek bizonyos körülmények között fonalas morfológiát mutatnak (2. kép).


1. kép: C. albicans sejtek sarjadzása.


2. kép: C. albicans sejtek csírázása.

A pszeudohifák végén képződő klamidospórák diagnosztikus jelentőségűek a Candida albicans és a többi Candida species egymástól való elkülönítése szempontjából [3.]. A Candida albicans valódi hifákat is képezhet, ahol szeptumok választják el egymástól a sejtmagokat [9.]. Fontos elkülönítő próba a csíratömlőképzés (germináció) is: szérum jelenlétében a blasztospórák jellegzetes filamentumokat ("germ tube") képeznek. A germinális tubulus forma az élesztőhifa-átalakulás kezdeti stádiumának tekinthető [1.] (3. kép).


3. kép: C. albicans sejtek csíratömlőképzése.


Virulenciafaktorok

A patogén mikrobák azon tulajdonságait, amelyek elősegítik a fertőzés kialakulását, virulenciafaktoroknak nevezzük. Ezen virulenciafaktorok a Candida albicans esetén a következők:

‚ fenotípus-variabilitás,
‚ csírázási sajátság,
‚ a biológiai és inert felszínhez történő adhéziós képesség,
‚ bizonyos extracelluláris enzimek termelése [9., 10.].

A fenotípus virulenciafaktor volta ellen és mellett számos érv sorakoztatható fel. Több irodalmi adat utal arra, hogy a normál vagy általános morfotípusok virulensebbek, mint variánsaik [10.]. Ugyanakkor hüvelycandidosisban szenvedő betegekből származó izolátumok között nagy gyakorisággal fordulnak elő nagy morfológiai variabilitással rendelkező törzsek [11.].

Számos egymástól eltérő környezeti tényező ismert, amely csírázást, illetve fonalas növekedést indukál. Ilyenek például: in vitro a birka, és a humán szérum [12., 13.], az N-acetil-D-glükózamin [14.], valamint az anaerob körülmények [15.]. Több szerző a csírázó sejteket invazívabbnak tekinti, mint az élesztőalakokat [16., 17.], és a legújabb kutatásokban a fonalasodni nem képes Candida albicans mutánsok avirulensnek bizonyultak [18.].

A gazdaszervezet sejtjeinek felszínét alkotó lipidek és proteinek hidrolíziséért felelős enzimek (extracelluláris aszpartátproteáz, foszfolipáz) szintén fontos szerepet játszanak a fertőzés kialakításában: virulenciafaktorként szerepelnek [19., 20.].

A fertőzés első lépcsője a gombasejt kitapadása a gazdaszervezet sejtjeihez: bőr, nyálkahártya [1.]. Bizonyított, hogy az inert és biológiai felszínekhez való tapadási képesség korrelál a virulenciával [21.]. Számos sejtfelszíni mannoproteint azonosítottak, mint lehetséges adhezineket [22., 23.]. Cutler (1991) szerint az adhéziós folyamatokban a hidrofób kölcsönhatások szerepe sem elhanyagolható. A Candida albicans esetén a sejtfelszín hidrofobicitása korrelál a gomba mind műanyagfelszínekhez [24., 25.], mind epithelialis sejtekhez [26.] való tapadási képességével (4. kép).


4. kép: C. albicans sejtek tapadása humán buccalis epithelialis sejtekhez


A száj mikroflórája

A szájüregi mikroorganizmusok egy olyan komplex ökoszisztémát alkotnak, amelyben a fogak, a nyelv, a gingivalis rés, a nyálkahártya és a nyál - annak ellenére, hogy sajátos mikrobapopulációval rendelkeznek - egymással dinamikus kölcsönhatásban vannak. Ezt a dinamikus kölcsönhatást folyamatosan befolyásolják a szervezetet érő külső hatások.
A szájüreg normál flórája életkoronként más és más. A magzati steril szájüreg a szülés során az anya hüvelyflórájának megfelelően változik, majd a szülést követő környezeti hatások következtében átalakul.

Csecsemő- és gyermekkorban részben a külvilágból, részben más testtájakból a szájüreg egyre növekvő számú mikrobával kerül kontaktusba. A tejfogak megjelenése és az ezzel összefüggő táplálkozási változások ismételt átalakulást okoznak a száj normál flórájában. A serdülőkorban jelentkező csíraszám-növekedés a mély felszíni fissurákkal és kifejezett interproximalis terekkel rendelkező maradó fogazat áttörésével van összefüggésben. A korai felnőttkorra jellemző carieses léziók megjelenése egy olyan új környezetet teremt, amiben a Streptococcus-fajok dominálnak. Felnőttkorban több tényező befolyásolja a szájüreg normál flóráját: a plaque-ok mennyisége, a chronicus periodontális folyamatok foka, a carieses léziók mennyisége és mértéke. Az említett okok együttesen befolyásolják a baktériumok lokális elszaporodását. A fogak elvesztésével a baktériumok kolonizációs lehetősége csökken [27.].


Anyag és módszertan

Felhasznált törzsek, törzsfenntartás

Vizsgálataink során egy flukonazol-rezisztens és egy flukonazol-szenzitív törzset használtunk fel, amelyeket Saboraud-dextróz-agaron (SDA) (4% glükóz, 1% mycologiai pepton [Oxoid], 2% agar) ferde tenyészeten, 4 oC-on tartottunk fenn. Az átoltás háromhavonta történt.


Növekedési vizsgálatok

A két törzs növekedésének vizsgálata Saboraud-dextróz-táptalajban (SDB) (4% glükóz, 1% mycologiai pepton) történt. Az élesztősejteket 20 ml SDB tápoldatban, 18 órán át, 30 oC-on előinkubáltuk, majd ezeket a sejteket oltottuk be SDB tápoldat, illetve a megfelelő koncentrációban nyálat (50%, 70%) tartalmazó SDB tápoldat 2,5-2,5 ml-ébe úgy, hogy az optikai denzitás 640 nm-en 0,1 legyen. A sejteket 30 oC-on inkubáltuk. A növekedést 24 órán át 640 nm-en történő fotometrálással követtük nyomon.


Inert felszínhez történő adhézió vizsgálata

A vizsgálat során az élesztősejteket 30 oC-on 18 órán át SDB tápoldatban, illetve a megfelelő mennyiségű nyálat tartalmazó SDB tápoldatban előinkubáltuk. Ezt követően a sejteket foszfátpufferrel mostuk (PBS: 0,2M Na2HPO4/NaH2PO4, 0,15M NaCl, pH: 7,2) (Janetzki K24 típusú centrifuga 3000 rpm, 10 perc), majd Bürker-kamra segítségével meghatároztuk a térfogategységre eső sejtszámot, ezt követően a sejtszuszpenziót 5x107 sejt/ml koncentrációra hígítottuk. Az ismert tömegű akrilátlapokat (0,5 x 0,5 x 0,1 cm) 2,5 ml 5x107 sejt/ml koncentrációjú sejtszuszpenzióban 1 órán át 30 oC-on "fej-láb" rázattuk. Ezután a lapokat PBS-sel mostuk, eltávolítva ezzel a ki nem tapadt sejteket. A lapokat 2,5-2,5 ml SBD tápoldatba helyeztük, és 20 órán át 30 oC-on inkubáltuk. A növekedés a kitapadt sejtszám függvénye. Az élesztősejtek mennyiségét 640 nm-en történő fotometrálással határoztuk meg. Az összehasonlíthatóság érdekében az optikai denzitást az akrilátlapok tömegére vonatkoztattuk [Fekete-Forgács és munkatársai 1999.].


Célkitűzések

A kísérletsorozatban arra kerestük a választ, vajon milyen mértékben képes a nyál meggátolni a Candida albicans növekedését, valamint annak inert felszínhez való tapadását. Vizsgálataink alapjául azon ismeretek szolgáltak, amelyek szerint a nyál, a benne található IgA, lizozim és laktoferrin összetevők miatt, antimikrobás hatással rendelkezik. Ezt a hatást az oly gyakran előforduló szájüregi gombás fertőzések nem igazolják, ezért kerestük a nyál antifungális hatásának mértékét. Tanulmányoztuk a nyálnak mind a Candida albicans növekedésére, mind az akrilátlapokhoz való adhéziójára kifejtett hatását.


Eredmények

A nyál Candida albicans növekedésére gyakorolt hatása

Különböző koncentrációjú nyálat tartalmazó táptalajon vizsgáltuk a növekedést. Vizsgálataink során a kontroll - azaz a nyálat nem tartalmazó - táptalajban lévő élesztők növekedéséhez hasonlítottuk a 25%, az 50% és a 70% nyálat tartalmazó táptalajban lévő élesztők növekedését. Kísérletünket mind a flukonazol-rezisztens, mind a flukonazol-szenzitív törzs esetén elvégeztük. A növekedést 24 órán át spektrofotometriásan követtük nyomon. Az abszorbanciát az idő függvényében vizsgálva láthatjuk, hogy a különböző Candida törzsek esetén a kontrollhoz képest a 25% (0,25 ml), az 50% (0,5 ml), valamint a 75% (0,75 ml) nyálat tartalmazó tápoldatban 8-10%-ban csökkent a gomba növekedése (1-2. ábra).


1. ábra: A Candida albicans flukonazol-rezisztens törzsének növekedése nyál jelenlétében.


2. ábra: A Candida albicans flukonazol-szenzitív törzsének növekedése nyál jelenlétében.


A nyál jelenlétében előtenyésztett Candida albicans tapadása
akrilátlapokhoz

Vizsgáltuk, hogy változik-e a nyál jelenlétében előtenyésztett élesztősejtek kitapadása a műfogsor alapanyagát képező akrilátfelszínhez. Kísérletünkben 50% (0,5 ml) nyálkoncentrációt tartalmazó tápközegben előtenyésztett élesztősejteket akrilátlapok jelenlétében "fej-láb" rázattunk. Ezt követően az akrilátlapokra kitapadt sejteket 18 órán át inkubáltuk. Az élesztősejtek mennyiségét 640 nm-en történő fotometrálással határoztuk meg. Az összehasonlíthatóság érdekében az optikai denzitást az akrilátlapok tömegére vonatkoztattuk. Vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy - amint azt a 3. ábra is szemlélteti - a két különböző törzs esetén az akrilátlapokhoz való tapadás 7-8%-os gátlása figyelhető meg.


3. ábra: Nyál jelenlétében előtenyésztett Candida albicans tapadása akrilátlapokhoz.


Megbeszélés

Közismert, hogy a gombás fertőzések gyakorisága, súlyossága az utóbbi években jelentősen fokozódott [35., 36., 37.]. Ugyanakkor az is ismeretes, hogy az egészséges lakosság normál flórájának (száj, hüvely) tagja lehet az egyik legjelentősebb gombás fertőzést kiváltó Candida albicans. Mind-
ezek ismeretében kezdtük el vizsgálni ezen élesztő adhézióját a protézis alapanyagát alkotó akrilátlapokhoz, illetve ezen adhézió megszüntetése érdekében hajtottunk végre kísérleteket.

Megvizsgáltuk a nyál Candida albicans gombának növekedésére, valamint akrilátlapokhoz való kitapadására kifejtett hatását. In vitro körülmények között a növekedés kismértékű gátlása volt tapasztalható alacsonyabb nyálmennyiség esetén. A nyál nagyobb mennyisége, vélhetően tápanyagforrásként való felhasználása miatt, a kísérleti körülmények között inkább serkentőnek bizonyult. A nyál az alkalmazott mennyiség következtében Candida albicans akrilátlapokhoz történő adhézióját gátolta.